如何利用Primer6.0进行引物的设计？
1.首先，选取目的基因序列，对格式没有什么要求，只需要将目的基因序列复制就可以。
2.打开File目录下的New，选择Sequence。这里的另一个Project选项是导入文件的方式，也就是将目的基因以文件形式保存的可以直接导入文件。一般通过复制的方式会更方便。
3.打开Sequence后，会弹出粘贴框，只需要将刚刚复制的基因序列粘贴上即可，然后点击下方的Add。
4.选择上方的红蓝双向箭头的按钮进行引物设计，在设计开始前可以更改设计的参数，包括搜索的碱基范围、引物的长度，碱基数，设计结果显示的引物对数等。
5.设置完参数后，点击下方的Search，软件开始分析设计，完成后，点击OK。设计结果就会在下面显示出来。
6.结果中蓝色为前引物，红色为后引物，Rating是对引物的综合评价分数，在上方也会显示引物的优劣，最好的为Best，中等为Good，最次的为Poor。一般选择引物都为Best或Good，其它显示均是无法使用的。
7.在右边还有两个选项，All Primers可以查看可选择的多对不同引物。可以根据需要选择合适位置和适当产物长度的引物。选择后需要点击下方的Replace才能替换。
8.All Structers则可以查看当前选定引物的结构，如发夹结构，引物二聚体和重复碱基等。
9.引物选定完成后，点击下方的引物序列，再右键会弹出复制信息选项，进而将设计好的引物导出。也可以直接以文件的形式将结果导出。
primer如何设计引物？
首先,选取目的基因序列,对格式没有什么要求,只需要将目的基因序列复制就可以。
2.打开File目录下的New,选择Sequence。这里的另一个Project选项...
3.打开Sequence后,会弹出粘贴框,只需要将刚刚复制的基因序列粘贴上即可,...
4.选择上方的红蓝双向箭头的按钮进行引物设计,在设计开始前可以更改设计的参数,...
oligo calc如何看引物好坏？
1、duplex formation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，主要是看引物3‘端有无配对碱基(最好没有)。其中的current oligo是当你对引物进行了编辑（如加入酶切位点）时，对原始引物进行的分析。（下同）形成的二聚体要看能值G(得它不会输入啊！)，能值越低越好，最好不要超过4.5（下同）
2、hairpin formation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3’端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。如果引物中加入酶切位点，可能会有发夹结构且能值不会太低，这就需要灵活控制退火温度了。
3、composition and Tm:分析上下游引物的碱基组成，GC比和Tm值，原则我就不多说了。
4、false priming site: 如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3‘端）是否与特定模板的其他位点结合。一般错配的引发效率以不超过100为好，但并不绝对，如果正确结合位点的引发效率为450以上，而有一个错配的引发效率是120左右的，这个引物也是可以接受地！！
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