怎样在NCBI的primer blast里设计Q-PCR的引物？
方法/步骤
1、首先打开NCBI，选择“Nucleotide”，并在搜索框输入基因名。一般用目标基因的突变体1去设计引物，也就是要选择目标基因的“transcript variant 1, mRNA ”,没有1就用2、3，以此类推。因为是Q-PCR，所以要去掉内含子，因此用mRNA。
2、从上一个页面点击FASTA，可以看到mRNA的序列。
3、搜索“NCBI BLAST”并点击进入，可以看到如下界面，往下拉。
4、点击进入"Primer-BLAST"
5、从第二步的页面复制序列或者序列号，粘贴在第一个框里。修改产物长度，即“PCR product size”,一般为100-200之间最好。还要选择“Exon junction span”为“primer must span an exon-exon junction”,这是为了排除DNA污染。其它的参数都可以不改。
6、把网页往下拉到底，点击左下角的“Get Primers”，耐心等待几分钟，网页就会弹出设计好的引物。
7、最后一步就是选择引物了。要选择自我配对和互相配对度低，产物长度尽量小的等等。需要指出的是，要注意看引物对非目标基因的检测潜力，如果它对于目标基因相似基因扩出的产物长度与目标产物长度一样长，这个引物的非特异性就很强，不能要。
怎么设计扩全长的引物？
1 确定你的siRNA设计的位点是否特异
2 你研究的基因是否有多个剪切体
3 你的qPCR的引物是否设计在全长蛋白的那个剪切体上
如果你的siRNA设计的位点在isoformA上，但是检测的蛋白是isoformB表达出来的，那么你的qPCR的结果可能和蛋白的表达变化不一致。
primerbank里面的引物靠谱吗？
primerbank靠谱吗？
它是靠谱的，PrimerBank 是一个 PCR 引物的公共数据库。其引物可以用于 PCR 或 qPCR，共包含超过 306 800 个引物，涵盖大多数已知的人和小鼠基因。
qpcr引物可以当普通引物用吗？
把PCR的引物用在qPCR里一般来说还是可以的，虽然如果你们实验室跟其他人共用一台仪器，其他等着用的人看到你的程序可能会骂街。但是qPCR引物并不总能用于PCR（或者说有意义的PCR）。因为二者实验目的不同。
PCR的实验目的一般是扩增某一目的片段，某一基因，而qPCR只需要确定是否有，有多少。所以一般的，PCR会扩增比较长的片段，而qPCR一般只会扩增很短的一小段。